Líneas disponibles > Características de la línea [PD] FiPS022-V4F-15

Nombre de la línea: [PD] FiPS022-V4F-15

Tipo de línea celular : hiPSC

Muestra biológica de origen:

Fibroblastos de dermis humanos

Datos relativos a la muestra biológica:

Fecha de donación: 1/12/2010
Fecha de uso: 15/12/2010

La muestra de origen presenta alguna patología: No / Sí
Enfermedad de Parkinson
Mutation: LRRK2 G2019S heterozygote with early onset PD (40 aa) Mutation

Descripción general del proceso de generación utilizado:

Constructos y producción retroviral
Los cDNA humanos KLF4, SOX2 y c-MYC-T58A y de ratón OCT4 se amplificaron a partir de RNA total por RT-PCR. Los cDNA amplificados a partir de KLF4, SOX2 y c-MYC-T58A se clonaron en un vector modificado pMSCV puro que permite la expresión de N-terminal marcado con Proteina FLAG. El cDNA de Oct-4 fue clonado en un vector modificado pMXs expresando N-terminal FLAG-Oct4-VP16-Orange.

Los retrovirus de los cuatro factores fueron producidos independientemente después de la transfección de la línea celular Phoenix Amphotropic, utilizando Fugene 6 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 24 horas después de la transfección, se cambió el medio y las células fueron incubadas a 32ºC . Los sobrenadantes fueron recogidos tras 24 y 48 horas. Los sobrenadantes fueron filtrados (0,45μm poresize) y se añadió polibreno (5μg/ml).

Reprogramación de las células de Parkinson
24 horas antes de la infección, los fibroblastos fueron sembrados (1x105cels/pocillo de placas de 6 pocillos). Las células fueron infectadas mediante la infección por centrifugación durante 45 minutos a 750g a 32ºC, aplicando una mezcla de sobrenadantes retrovirales a partir de los 4 factores. Después de 24hs, se realiza una segunda infección. Tras 48 horas, las células fueron tripsinizadas y sembradas sobre fibroblastos humanos irradiados en hES media.

Soporte celular y medio de cultivo utilizados:

Soporte celular: human foreskin fibroblasts (ATCC, American Type Culture Collection, CCD1112Sk).

Medio de cultivo: Knockout Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with 2 mmol/l
GlutaMAX (Gibco, InVitrogen corporation), 0,05mmol/l 2-mercaptoethanol (Gibco, InVitrogen corporation), 8 ng/ml basic fibroblast growth factor (bFGF) (Invitrogen), 1% non-essential amino acids (Cambrex), 20% Knockout Serum Replacement (InVitrogen) y 0,5% Penicillin-Streptomycin (Gibco, InVitrogen corporation).

Expansión de la línea:

Método de pase: enzimático/mecánico
Pase mínimo depositado: pase 12

Características de la línea

Código                                                     [PD] FiPS022-V4F-15                               
   
Cariotipo 46; XY t (6,12)*
* Los fibroblastos del paciente también presentan la translocación
   
Marcadores de pluripotencia                                                        
Oct 4 +
Nanog +
Sox 2 +
SSEA-3 +
SSEA-4 +
TRA1-60 +
Tra1-81 +
Fosfatasa alcalina +
   
Viabilidad congelación/descongelación

si

In vivo

si

In vitro  
ectodermo (Tuj-1) +
endodermo (AFP; FoxA2) +
mesodermo (SMA) +
   
Análisis microbiológico  
Bacteriología -
Micología -
Micoplasma -
   
Tipage HLA no
   
Huella molecular realizado
   
En caso de células hiPS  
Integración de los transgenes (por gPCR) SI/no
OCT4, SOX2, KLF4 y c-myc  
Silenciamiento de los transgenes (por RT-PCR) SI/no
   

Documento en PDF:

[PD] FiPS022-V4F-15  (1994Kb)


© Centro de Medicina Regenerativa de Barcelona 2009-2019 - Nota legal - Política de cookies - Créditos - Accesibilidad